Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand (Bertrand’s method)

Nguyên tắc của các phương pháp hoá học sử dụng để định lượng đường khử đều dựa trên khả năng khử các hợp chất khác nhau của chúng. Một trong những phương pháp định lượng đường khử chính xác và phổ biến là phương pháp Bertrand. Phương pháp này cho phép định lượng đường khử chính xác trong khoảng từ 1 – 40mg.

1. Nguyên tắc định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand

Trong môi trường kiềm, các đường khử (glucose, fructose, maltose…) dễ dàng khử đồng (II) (Cu²⁺) thành đồng (I) (Cu¹⁺) theo phản ứng Fehling. Kết tủa đồng (I) oxyt Cu₂O có màu đỏ gạch, có khả năng khử với muối sắt (III) (Fe³⁺) tạo muối sắt (II) (Fe²⁺) trong môi trường axit. Lượng sắt (II) tạo thành được xác định bằng phản ứng oxy hoá khử với dung dịch KMnO₄ trong môi trường axit.

Dựa vào lượng KMnO₄ sử dụng tính được lượng Cu₂O và từ đó xác định được hàm lượng đường khử trong dung dịch mẫu bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO₄ và đường khử của Bertrand.

2. Các phản ứng xảy ra trong quá trình xác định hàm lượng đường khử

Quá trình định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand diễn ra một chuỗi các phản ứng liên tục bao gồm:

• Khi trộn dung dịch fehling (I) và fehling (II), phản ứng xảy ra theo hai giai đoạn. Đầu tiên, kết tủa đồng hidroxyt Cu(OH)₂ màu xanh da trời tạo thành:

• Sau đó, Cu(OH)₂ tác dụng vối muối Seignett tạo muối phức hoà tan, dung dịch có màu xanh thẫm:

• Muối phức trên là một hợp chất không bền. Các đường có chứa nhóm andehyt hoặc xeton dễ dàng khử Cu²⁺ thành Cu¹⁺, tạo ra kết tủa đồng (I) oxyt và đường bị oxy hoá khi tác dụng với dung dịch fehling:

• Để định lượng đồng (I) oxit (CU₂O) tạo thành, quá trình oxy hoá Cu₂O bằng sắt (III) sunfat trong môi trường axit sunfuric diễn ra:

• Cuối cùng là phản ứng định lượng sắt (II) tạo thành:

Đọc thêm bài viết: Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS, Phương pháp xác định carbohydrate tổng số (Phenol-Sulfuric Acid Method)

3. Hóa chất cần chuẩn bị

• Thuốc thử Fehling: bao gồm Fehling A và Fehling B tỉ lệ 1:1
• Fehling A: hòa tan 40 g đồng sulfat ngậm 5 phần tử nước (CuSO₄.5H₂O) trong nước cất và pha thành 1000 mL.
• Fehling B: hòa tan 200 g Kali Natri tactarat C₄H₄O₆NaK.4H₂O (hay muối Seignett) trong 100 mL nước cất, thêm vào đó dung dịch natri hydroxit đã được pha trước (150 g natri hydroxit hòa tan trong 200 mL nước cất). Lắc đều và thêm nước cất đủ 1000 mL.
• Dung dịch Fe₂(SO₄)₃ trong H₂SO₄: hòa tan 50 g sắt (III) sulfat trong khoảng 100 mL nước cất, thêm vào đó 200 ml axit sulfuric đậm đặc (d = 1,84) để nguội và thêm nước cất vừa đủ 1000 mL.
• Dung dịch KMnO₄ 1/30N: cân 1,06 gam KMnO₄, hoà tan trong 1 lít nước cất, đun nóng (KMnO₄ dễ tan trong nước nóng).

4. Chi tiết tiến hành thí nghiệm

Bước 1. Lấy 10 mL dung dịch mẫu chứa khoảng 0,8 – 40 mg đường vào bình tam giác dung tích 250 mL.
Bước 2. Thêm 10 mL thuốc thử Fehling
Bước 3. Đun sôi hỗn hợp 3 phút, tính từ khi xuất hiện bọt nước đầu tiên.
Bước 4. Kết tủa đỏ xuất hịên trong bình. Để lắng kết tủa, lọc bằng bình lọc chân không Buchner (qua phễu lọc xốp G4 chuyên dùng để định lượng đường).

Bước 5. Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước nóng. Cần chú ý giữ phần lớn kết tủa đồng (I) oxit trên phễu lọc cũng như ở bình tam giác luôn được phủ bởi một lớp nước, tránh cho Cu₂O khỏi bị oxy hoá bởi oxy không khí.
Bước 6. Hoà tan kết tủa đồng (I) oxyt vào bình Buchner bằng cách cho khoảng 5 mL dung dịch sắt (III) sunfat trong H₂SO₄ và dùng đũa thuỷ tinh khuấy thật cẩn thận để hòa tan hoàn toàn kết tủa đồng oxyt trên phễu.
Bước 7. Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3 – 4 lần bằng nưốc cất nóng, cho vào bình bình tam giác 100 mL.
Bước 8. Chuẩn độ dung dịch thu được bằng KMnO₄ 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 20-30 giây.
Bước 9. Từ lượng KMnO₄ 1/30N dùng để chuẩn độ, tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường khử của Bertrand để suy ra lượng đường có trong mẫu phân tích.

Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất.

4. Tính toán kết quả hàm lượng đường khử

Đối với các mẫu thực phẩm cần chuẩn bị mẫu thí nghiệm (như hạt, quả, củ,…) cần tiến hành chuẩn bị dung dịch mẫu bằng phương pháp chiết. Thể tích hỗn hợp mẫu sau đó được chuyển toàn bộ vào bình định mức thể tích V mL.

Hàm lượng đường khử được xác định theo công thức sau:

Trong đó:
R – Hàm lượng đường khử (%)
r – số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số mL KMnO₄ 1/30N dùng để
chuẩn độ mẫu phân tích trừ đi số mL KMnO₄ 1/30N dùng để chuẩn độ mẫu nước cất (mẫu không).
V – dung tích bình định mức (mL)
V₁– lượng dung dịch lấy để xác định đưòng khử (mL)
w – lượng mẫu thí nghiệm (g)
1000 – hệ số đổi gam thành mg

5. Lưu ý quan trọng khi định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand

Sau khi đun sôi, dung dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trưng. Nếu dung dịch bị mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vào không đủ để oxy hoá hoàn toàn lượng đường có trong mẫu thí nghiệm. Trong trường hợp đó, phải làm lại thí nghiệm vối lượng dung dịch mẫu ít hơn hoặc với lượng thuốc thử Fehling nhiều hơn.