Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid Dinitrosalicylic (DNS Method)

Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid Dinitrosalicylic (DNS hay DNSA) là phương pháp so màu (Colorimetric Method) rất phổ biến vì tính đơn giản và khả năng cho kết quả nhanh chóng.

Quan trọng: Các đường khử khác nhau cho màu sắc khác nhau với thuốc thử DNS. Các đường có nhiều liên kết trong phân tử bị oxy hóa mạnh hơn, tạo màu có độ hấp thụ cao hơn, dẫn đến cho kết quả đo cao hơn nhiều khi sử dụng glucose làm chuẩn. Do đó, phương pháp yêu cầu thiết lập đường chuẩn riêng biệt cho từng loại đường khử (fructose, glucose, maltose,…). Không nên sử dụng phương pháp DNS để phân tích khả năng khử của hỗn hợp đường, ví dụ như sản phẩm thủy phân của enzyme α-amylase.

1. Nguyên tắc phương pháp xác định hàm lượng đường khử DNS

Axit 3,5-Dinitrosalicylic (DNS hay DNSA) được sử dụng rộng rãi trong quá trình xác định hàm lượng đường khử.

Nguyên tắc phương pháp DNS dựa trên sự phát hiện nhóm carbonyl (C=O) tự do của đường khử. Cụ thể, khi phản ứng với thuốc thử, quá trình oxy hóa nhóm chức aldehyde (trong glucose) và nhóm chức xeton (trong fructose) sẽ diễn ra. Axit 3,5-Dinitrosalicylic bị khử thành axit 3-amino 5-nitrosalicylic (ANS), có màu đỏ cam trong môi trường kiềm và độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540 nm.

2. Chi tiết cách tiến hành định lượng đường khử bằng phương pháp DNS

2.1. Hóa chất cần chuẩn bị

• Axit ditrosalicylic (DNS)
• Muối Kali natri tartrate (Muối tartrat kép)
• NaOH 2N
• Chất chuẩn: fructose/ glucose/ maltose

2.2. Cách pha thuốc thử DNS

Bước 1. Hòa tan 300g muối Kali natri tartrate trong 500 mL nước cất (còn gọi là dung dịch muối Rochelle). Cho muối vào nước từ từ đến hết.
Bước 2. Chuẩn bị 200 mL dung dịch natri hydroxit 2N. Dùng đũa thủy tinh khuấy đến hòa tan hoàn toàn.
Bước 3. Hòa tan 10g DNS trong 200 mL natri hydroxit đã chuẩn bị ở bước 2 (sử dụng máy khuấy từ có gia nhiệt nhẹ).
Bước 4. Trộn dung dịch ở bước 1 và bước 3.
Bước 5. Định mức đến thể tích 1 L.
Bước 6. Bảo quản thuốc thử trong chai thủy tinh sẫm màu.

Chuẩn 3 mL thuốc thử DNS bằng HCl 0,1 N với chỉ thị phenolphtalein. Nếu hết 5-6 mL là đạt. Nếu cần, bổ sung thêm NaOH.

2.3. Thiết lập đường chuẩn

• Dung dịch chuẩn (fructose/ glucose/ maltose) 100 μg/mL: 100ml
• Chuẩn bị các mẫu phản ứng theo bảng:

• Mẫu trắng (Blank): Thay 3 mL hỗn hợp dung dịch chuẩn và nước cất bằng 3 mL nước cất.
• Đặt các ống vào nồi cách thủy sôi trong 5 phút và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Màu đỏ cam hình thành.
• Đo độ hấp thụ quang ABS ở bước sóng 540 nm so với mẫu trắng.
• Thiết lập đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng chất chuẩn và độ hấp thụ quang.

2.4. Quy trình xác định đường khử bằng phương pháp DNS

• Dùng pipet chuyển 3 mL mẫu xác định đường khử vào ống nghiệm có nắp vặn.
• Thêm 1 mL thuốc thử DNS vào dung dịch mẫu.
• Mẫu trắng (Blank) được chuẩn bị bằng cách thêm 1 mL thuốc thử DNS vào 3 mL nước cất.
• Đặt các ống vào nồi cách thủy sôi trong 5 phút
• Làm nguội mẫu nhanh đến nhiệt độ phòng.
• Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm.
• Tham chiếu đường chuẩn đã lập, tính toán được hàm lượng đường khử của mẫu đo.

Đọc thêm bài viết: Phương pháp xác định carbohydrate tổng số (Phenol-Sulfuric Acid Method)

3. Các lưu ý quan trọng khi tiến hành

• Công thức pha thuốc thử DNS; nồng độ đường khử lập đường chuẩn; thể tích mẫu và thuốc thử đem phân tích có thể thay đổi tùy thuộc vào các tài liệu khoa học được công bố.
• Màu chỉ phát triển trong điều kiện kiềm: các mẫu có tính axit nên được trung hòa.
• Phương pháp này không nhạy với mẫu có hàm lượng đường khử dưới 100 μg glucose.
• Natri sulfat 0,5% w/v (1 mL) có thể được thêm vào hỗn hợp sau phản ứng để thu được màu ổn định.

KẾT LUẬN

Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS cho kết quả nhanh chóng, thực hiện dễ dàng. Tuy nhiên, các đường khử khác nhau cho màu sắc khác nhau với thuốc thử DNS. Do đó, phương pháp này không được khuyến khích dùng cho xác định hỗn hợp đường khử.

CÁC CÂU HỎI THƯỜNG GẶP (FAQS)