Tinh bột kháng là thành phần thực phẩm chức năng đang nhận được sự quan tâm mạnh mẽ bởi những tính chất chức năng và đặc tính công nghệ ưu việt của nó. Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột kháng tuân thủ tiêu chuẩn AOAC Method 2002.02, AACC Method 32-40.01, CODEX Type II Method sẽ được trình bày chi tiết trong bài viết này, phương pháp có thể áp dụng tại các cở sở nghiên cứu và phòng kiểm soát chất lượng của doanh nghiệp.

1. Tinh bột kháng là gì?

Tinh bột kháng còn được gọi là tinh bột bền (resistant starch). Theo Englyst và cộng sự (1982), dựa vào khả năng kháng tiêu hóa, tinh bột được chia thành ba loại:

  • Tinh bột tiêu hóa nhanh (Rapidly Digestible Starch);
  • Tinh bột tiêu hóa chậm (Slowly Digestible Starch) và
  • Tinh bột kháng (Resistant starch).

Tinh bột kháng (RS) là phần tinh bột không bị phân hủy bởi enzyme của con người trong ruột non. Nó đi vào ruột già và được lên men một phần hoặc toàn bộ. Tinh bột kháng thường được coi là một trong những thành phần tạo nên tổng chất xơ (TDF) trong các sản phẩm thực phẩm.

2. Nguyên tắc của phương pháp xác định hàm lượng tinh bột kháng

Xác định hàm lượng tinh bột kháng là một quy trình phức tạp. Các mẫu được ổn nhiệt và lắc liên tục với enzyme α-amylase tuyến tụy và amyloglucosidase (AMG) trong 16 giờ ở 37°C, trong thời gian này, tinh bột không kháng (non-resistant starch) bị hòa tan và thủy phân thành D-glucose dưới tác động đồng thời của hai enzyme. Sau đó tinh bột kháng được thu bằng cách kết tủa với cồn, ly tâm thu kết tủa và phần chất lỏng nổi.

Tinh bột kháng sau đó được hòa tan và thủy phân thành glucose dưới tác dụng của enzyme amyloglucosidase. D-Glucose được định lượng bằng thuốc thử glucose oxidase/peroxidase (GOPOD) và tính toán được hàm lượng tinh bột kháng của mẫu thử.

Nguyên tắc phương pháp xác định hàm lượng tinh bột kháng AOAC
Nguyên tắc phương pháp xác định hàm lượng tinh bột bền
trong các mẫu thực phẩm

Tinh bột không kháng (Non-resistant starch) hay tinh bột hòa tan được xác định bằng cách gộp các phần dung dịch rửa kết tủa, định mức thể tích thành 100 mL và đo hàm lượng D-glucose bằng GOPOD.

3. Thuốc thử và thiết bị định lượng tinh bột kháng

3.1. Thuốc thử

1. Enzyme Amyloglucosidase (AMG) [12 mL, 3.300 U/mL trên tinh bột hòa tan (hoặc 200 U/mL trên p-nitrophenyl β-maltoside)] ở pH 4,5 và 40°C.

Enzyme Amyloglucosidase pha loãng (300 U/mL). Pha loãng 2 mL dung dịch AMG 3.300 U/mL thành 22 mL với dung dịch đệm natri maleat 0,1 M pH 6,0. Chia thành các phần 5 mL và bảo quản dưới -10°C trong ống polypropylen giữa các lần sử dụng.

2. Enzyme α-amylase tuyến tụy (Pancreatin, 10 g, 3 Đơn vị Ceralpha/mg).

Ngay trước khi sử dụng, hòa tan 1 g α-amylase tuyến tụy trong 100 mL dung dịch đệm natri maleat (100 mM, pH 6.0) và khuấy từ trong 5 phút.

Thêm 1,0 mL dung dịch AMG pha loãng (300 U/mL) và trộn đều. Ly tâm ở tốc độ > 1.500 g trong 10 phút và gạn cẩn thận phần dung dịch nổi phía trên. Chỉ sử dụng trong ngày.

3. Thuốc thử xác định Glucose (Thuốc thử GOPOD)

4. Dung dịch chuẩn D-Glucose (5 mL, 1,0 mg/mL)

5. Tinh bột kháng mẫu đối chứng. Hàm lượng tinh bột kháng đã được xác định.

6. Dung dịch đệm natri maleat (100 mM, pH 6,0) bổ sung 2 mM canxi clorua dihydrat và natri azit (0,02% w/v). Hòa tan 23,2 g axit maleic (Sigma cat. no. M0375) trong 1600 mL nước cất và điều chỉnh độ pH đến 6,0 bằng natri hydroxit 4 M (160 g/L). Thêm 0,6 g canxi clorua dihydrat (CaCl2.2H2O) và 0,4 g natri azit và hòa tan. Định mức đến thể tích 2 lít. Ổn định trong 12 tháng ở 4°C.

7. Dung dịch đệm natri axetat (1,2 M, pH 3,8). Thêm 68,6 mL axit axetic băng (1,05 g/mL) vào 800 mL nước cất và điều chỉnh đến pH 3,8 bằng natri hydroxit 4 M. Định mức đến thể tích 1 lít bằng nước cất. Ổn định trong 12 tháng ở nhiệt độ phòng.

8. Dung dịch đệm natri axetat (100 mM, pH 4,5). Thêm 5,8 mL axit axetic băng vào 900 mL nước cất và điều chỉnh đến pH 4,5 bằng natri hydroxit 4 M. Điều chỉnh thể tích đến 1 L bằng nước cất. Ổn định trong 2 tháng ở 4°C.

9. Dung dịch kali hiđroxit (2 M). Thêm 112,2 g KOH vào 900 mL nước khử ion và khuấy tan. Điều chỉnh thể tích đến 1 lít. Ổn định > 2 năm ở nhiệt độ phòng.

10. Dung dịch ethanol (hoặc IMS) (khoảng 50% v/v). Thêm 500 mL ethanol (95% v/v hoặc 99% v/v) hoặc rượu metyl hóa công nghiệp (industrial methylated spirits (IMS), etanol biến tính; ~ 95% v/v etanol cộng với 5% v/v metanol) vào 500 mL H2O. Ổn định > 2 năm ở nhiệt độ phòng.

3.2. Thiết bị phân tích tinh bột kháng

  • Máy nghiền mẫu.
  • Máy ly tâm để bàn – Có khả năng ly tâm các ống nghiệm thủy tinh 16 x 120 mm với tốc độ xấp xỉ 1.500 g (~3.000 vòng/phút).
  • Bể cách thủy có lắc: cài đặt chuyển động tuyến tính với tốc độ 100 vòng/phút (tương đương với tốc độ lắc 200 nhịp/phút), chiều dài hành trình là 35mm ở 37°C.
  • Nồi cách thủy – Có khả năng duy trì 50 ± 0,1°C.
  • Máy vortex.
  • Máy khuấy từ.
  • Thanh khuấy từ 5 x 15 mm.
  • Máy đo pH.
  • Đồng hồ bấm giờ.
  • Cân phân tích (chính xác đến 0,1 mg).
  • Máy đo quang phổ – có khả năng hoạt động ở bước sóng 510 nm, tốt nhất là được lắp với cuvet dòng chảy (chiều dài đường truyền 10 mm).

4. Chuẩn bị mẫu xác định hàm lượng tinh bột kháng

Nghiền khoảng 50 g mẫu ngũ cốc hoặc thực vật đông khô hoặc sản phẩm thực phẩm khác bằng máy nghiền và rây qua sàng 1,0 mm. Chuyển tất cả nguyên liệu vào lọ nhựa miệng rộng và lắc đảo chiều để trộn đều. Các chế phẩm tinh bột công nghiệp thường được cung cấp ở dạng bột mịn nên không cần nghiền. Các mẫu tươi (ví dụ: đậu đóng hộp, chuối, khoai tây) đem xay bằng máy và rây sàng ~ 4,5 mm.

Xác định độ ẩm của mẫu khô theo phương pháp AOAC 925.10 và độ ẩm của mẫu tươi xác định bằng phương pháp đông khô sau đó sấy khô theo Phương pháp AOAC 925.10.

5. Quy trình xác định hàm lượng tinh bột kháng

5.1. Thủy phân và hòa tan tinh bột tiêu hóa

i. Cân chính xác 100 ± 5 mg mẫu trực tiếp vào ống có nắp vặn (ống nuôi cấy Corning®; 16 x 125 mm) và gõ nhẹ vào ống để đảm bảo mẫu rơi xuống đáy.

Đối với các mẫu ướt như đậu đóng hộp xay nhỏ hoặc sản phẩm thực phẩm, cỡ mẫu xấp xỉ 0,5 g (cân chính xác). Độ ẩm của nhóm mẫu này thường từ 60-80%.

ii. Thêm 4,0 mL dung dịch enzyme α-amylase tuyến tụy (10 mg/mL) có chứa AMG (3 U/mL) đã chuẩn bị vào mỗi ống.

iii. Đậy chặt nắp các ống, lắc đều trên máy vortex và đặt nằm ngang trong bể điều nhiệt nước có lắc, thẳng hàng theo hướng chuyển động ngang.

công thức tính toán hàm lượng tinh bột kháng

 iv. Ủ các ống ở 37°C và lắc liên tục (200 nhịp/phút) trong đúng 16 giờ (Lưu ý: đối với chuyển động tuyến tính, cài đặt 100 trên bể cách thủy tương đương với 200 nhịp/phút; 100 tiến và 100 lùi).

v. Lấy các ống ra khỏi nồi cách thủy và loại bỏ nước thừa trên bề mặt bằng khăn giấy. Tháo nắp ống và thêm 4,0 mL etanol (99% v/v) hoặc IMS (99% v/v), lắc đều.

vi. Ly tâm các ống ở 1.500 g (xấp xỉ 3.000 vòng/phút) trong 10 phút (không đậy nắp).

vii. Gạn cẩn thận phần nổi phía trên và tạo huyền phù lại bằng cách thêm 2 mL etanol 50% hoặc IMS 50% đồng thời khuấy mạnh trên máy vortex. Thêm 6 mL etanol 50% nữa, trộn đều và ly tâm lại ở 1.500 g trong 10 phút.

viii. Gạn phần dịch nổi phía trên và lặp lại bước tạo huyền phù và ly tâm thêm một lần nữa.

ix. Cẩn thận gạn phần nổi phía trên và úp ngược các ống trên giấy thấm để loại bỏ chất lỏng còn dư.

5.2. Phân tích hàm lượng tinh bột kháng

i. Thêm thanh khuấy từ (5 x 15 mm) và 2 mL KOH 2 M vào mỗi ống và khuấy trong khoảng 20 phút sử dụng hộp nước đá/nước trên máy khuấy từ để hòa tan RS.

Cách tạo ra tinh bột kháng foscitech

LƯU Ý: 1. Không trộn trên máy vortex vì có thể làm cho tinh bột bị nhũ hóa. 2. Đảm bảo ống được lắc vortex trong khi thêm dung dịch KOH. Điều này giúp tránh hình thành các cục tinh bột vón, sau đó sẽ khó hòa tan.

ii. Thêm 8 mL dung dịch đệm natri axetat 1,2 M (pH 3,8) vào mỗi ống và khuấy trên máy khuấy từ. Thêm ngay 0,1 mL AMG (3.300 U/mL), lắc đều và ổn nhiệt ở 50°C.

iii. Ủ trong 30 phút, thi thoảng lắc bằng máy vortex.

iv. Đối với các mẫu chứa > 10% RS: chuyển hỗn hợp sau khi ủ với AMG vào bình định mức 100 mL. Sử dụng một nam châm bên ngoài để giữ thanh khuấy trong ống trong khi tráng dung dịch từ ống. Định mức thành 100 mL bằng nước cất và lắc đều. Ly tâm một lượng nhỏ dung dịch ở 1.500 g trong 10 phút.

v. Đối với các mẫu chứa <10% RS: ly tâm trực tiếp các ống ở 1.500 g trong 10 phút (không pha loãng). Đối với các mẫu như vậy, thể tích cuối cùng trong ống là khoảng 10,3 mL (tuy nhiên, thể tích này sẽ thay đổi nếu các mẫu ướt được phân tích và phải tính toán dung sai thích hợp cho thể tích).

vi. Chuyển 0,1 mL phần dịch nổi thu được (lặp 2 lần) sau khi ly tâm vào các ống nghiệm thủy tinh (16 x 100 mm), thêm 3,0 mL thuốc thử GOPOD và ủ ở 50° C trong 20 phút.

vii. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm so với mẫu trắng thuốc thử.

Chuẩn bị mẫu trắng (mẫu Blank) bằng cách trộn 0,1 mL dung dịch đệm natri axetat 100 mM (pH 4,5) và 3,0 mL thuốc thử GOPOD.

Chuẩn bị chất chuẩn D-glucose (làm bốn lần) bằng cách trộn 0,1 mL D-glucose (1 mg/mL) và 3,0 mL thuốc thử GOPOD.

5.3. Phân tích hàm lượng tinh bột hòa tan

i. Gộp các phần dịch nổi phía trên thu được khi ly tâm (từ quá trình ủ ban đầu và hai lần rửa tiếp theo với etanol 50%) và định mức tới 100 mL bằng dung dịch đệm natri axetat 100 mM (pH 4,5). Lắc đều.

ii. Ủ 0,1 mL dung dịch (lặp 2 lần) với 10 μL dung dịch AMG loãng (300 U/mL) trong 20 phút ở 50°C. Thêm 3,0 mL thuốc thử GOPOD và ủ thêm 20 phút ở 50°C.

iii. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm so với mẫu trắng thuốc thử.

iv. Tính toán hàm lượng tinh bột không kháng (tinh bột hòa tan).

Tổng hàm lượng tinh bột là tổng của tinh bột kháng và tinh bột không kháng (hòa tan).

6. Công thức tính toán

Tính toán hàm lượng tinh bột kháng, tinh bột không kháng (hòa tan) và hàm lượng tinh bột tổng số (%, tính theo trọng lượng khô) trong các mẫu thử theo công thức dưới đây:

Công thức xác định hàm lượng tinh bột kháng

Trong đó:

  • OD: độ hấp thụ đo được so với mẫu trắng.
  • F: chuyển đổi từ độ hấp thụ sang microgam (độ hấp thụ thu được cho 100 μg D-glucose trong phản ứng GOPOD được xác định và F = 100 (μg D-glucose) chia cho độ hấp thụ GOPOD của 100 μg D-glucose này).
  • W: trọng lượng khô của mẫu được phân tích.

7. Các câu hỏi thường gặp (FAQs)

Phạm vi áp dụng và độ chính xác của phương pháp xác định hàm lượng tinh bột kháng AOAC 2002.02?

Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột kháng AOAC 2002.02 có thể áp dụng cho các mẫu chứa hàm lượng RS lớn hơn 2% w/w. Với những mẫu này, sai số chuẩn thường đạt được là ± 5%. Sai số cao hơn xảy ra đối với các mẫu có hàm lượng RS < 2% w/w.

TỪ VỰNG TIẾNG ANH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

  • Resistant starch: Tinh bột kháng tiêu hóa, tinh bột kháng, tinh bột bền
  • Rapidly Digestible Starch: Tinh bột tiêu hóa nhanh
  • Slowly Digestible Starch: Tinh bột tiêu hóa chậm
  • Non-resistant starch (solubilised starch): Tinh bột hòa tan
  • Denatured ethanol: ethanol biến tính
  • Total dietary fiber (TDF): chất xơ tổng số
  • Pancreatic α-amylase enzyme: Enzym α-amylase tuyến tụy.
Nguồn tham khảo
Tại Foscitech, chúng tôi nỗ lực cung cấp những kiến thức chuyên môn đáng tin cậy và bám sát thực tế nhất trong lĩnh vực khoa học và công nghệ thực phẩm. Chúng tôi sử dụng chính sách biên tập nội dung khắt khe để đảm bảo nội dung trên Foscitech là tốt nhất.

1. H. Englyst, H.S. Wiggins, J.H. Cummings, Determination of the non-starch polysaccharides in plant foods by gas-liquid chromatography of constituent sugars as alditol acetates, Analyst. 107 (1982) 307–318. https://doi.org/10.1039/AN9820700307.
2. McCleary, B. V. and Monaghan, D. A.. Measurement of Resistant Starch. J. AOAC International, 85 (2002), 665-675.
3. Megazyme. Resistant Starch Assay Protocol, (2023). 

Tham khảo bài viết vui lòng ghi rõ nguồn: https://foscitech.vn/xac-dinh-ham-luong-tinh-bot-khang-aoac-2002-02/

One Response

  1. Avatar for smorter giremal smorter giremal
    30/10/2024

Leave a Reply

Your email address will not be published