Xác định hoạt độ enzyme lactoperoxidase của sữa TCVN 11680:2011

Bài viết này hướng dẫn phương pháp xác định hoạt độ enzyme lactoperoxidase (Determination of the lactoperoxidase activity) trong sữa theo TCVN 11680:2011. Phương pháp này hoàn toàn tương đương với ISO/TS 17193:2011. Nội dung được trình bày ngắn gọn, nhấn mạnh các lưu ý và giải quyết các vấn đề phát sinh để người thực hiện dễ dàng áp dụng và hạn chế sai sót.

1. Đối tượng áp dụng của TCVN 11680:2011

TCVN 11680:2011 quy định phương pháp đo quang để xác định hoạt độ enzyme lactoperoxidase trong sữa trên 50 μ/L.

2. Nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme lactoperoxidase

Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme lactoperoxidase (unit of lactoperoxidase activity): Lượng enzym lactoperoxidase xúc tác chuyển đổi 1 μmol cơ chất trên mỗi phút.

Với sự có mặt của enzym lactoperoxidase có trong mẫu, ABTS [2,2′-azino-bis(axit 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)] được xúc tác chuyển đổi thành cation gốc tự do (ABTS+) ở pH 6,0 và 25°C. Lượng (ABTS+) giải phóng trong mỗi phút tỷ lệ với hoạt độ enzyme lactoperoxidase và được đo quang phổ ở 420 nm.

Cơ chế giải phóng ABTS+ dựa trên các phản ứng hóa học sau đây:

3. Thuốc thử, thiết bị và dụng cụ cần thiết

3.1. Thuốc thử

1. Dung dịch đệm phosphat, pH 6,0: Hòa tan 0,72 g dinatri hydrophosphat ngậm hai phân tử nước (Na2HPO4.2H2O) và 3,99 g kali dihydro phosphat (KH2PO4) trong khoảng 450 ml nước đựng trong cốc có mỏ. Chỉnh pH của dung dịch đến khoảng 6,0 ± 0,03 bằng natri hydroxit, kali hydroxit loãng hoặc dung dịch axit phosphoric, nếu cần. Chuyển dung dịch này vào bình định mức 500 ml. Thêm nước đến vạch và trộn đều.
2. Dung dịch hydro peroxit: Dùng pipet lấy 0,1 ml H2O2 30 % khối lượng cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Thêm nước đến vạch và trộn đều.
   CẢNH BÁO – Hydro peroxit là chất ăn mòn và không được để tiếp xúc với các kim loại hoặc các chất hữu cơ dễ cháy để ngăn ngừa hình thành các hỗn hợp gây nổ. Chuẩn bị dung dịch hydro peroxit ngay trước khi sử dụng.
3. Dung dịch thuốc thử ABTS 2 mmol/l (dung dịch muối diamoni của 2,2-azino-bis (axit 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) [C16H16N4O6S4 (NH4)2])

Cân 55 mg muối di-amoni của ABTS cho vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 30 ml dung dịch đệm phosphat 6,0 để hòa tan muối. Sau đó, thêm 1,0 ml dung dịch hydro peroxid. Thêm dung dịch đệm đến vạch 50 ml và trộn đều.

3.2. Thiết bị và dụng cụ

1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg, có thể đọc đến 0,1 mg.
2. Máy đo pH, có khả năng đo được 0,1 đơn vị pH, có thể đọc đến 0,01 đơn vị.
3. Máy đo quang phổ, có khả năng đo độ hấp thụ ở 420 nm, có bộ giữ cuvet kiểm soát được nhiệt độ ở 25 °C ± 0,5 °C.
4. Cuvet bằng chất dẻo, chiều dài đường quang 1,0 cm, có nắp đậy
5. Pipet xả hết hoặc pipet có cơ cấu piston
6. Bình định mức một vạch, dung tích 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 500 ml
7. Nồi cách thủy hoặc bể làm khô, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 25 °C ± 0,5 °C.

4. Quy trình xác định xác định hoạt độ enzyme lactoperoxidase trong sữa

4.1. Chuẩn bị mẫu thử

Làm ấm mẫu thử bảo quản lạnh đến nhiệt độ phòng và trộn kỹ. Trong mọi trường hợp, nhiệt độ không được vượt quá 35 °C.

Tùy thuộc vào hàm lượng lactoperoxidase của mẫu, trộn mẫu thử với nước theo tỷ lệ phù hợp tính theo thể tích ít nhất 1 → 5.

Để xác định hoạt độ enzyme lactoperoxidase, chênh lệch độ hấp thụ, ∆A nằm trong khoảng 0,02 phút-1 đến 0,5 phút-1. Phụ thuộc vào phạm vi đo, áp dụng các dung dịch pha loãng với nước như trong Bảng 1.

Để pha loãng các mẫu sữa tiệt trùng UHT, phải sử dụng tỷ lệ 1→ 5 (theo thể tích).

4.2. Xác định hoạt độ enzyme

Trước khi đo quang, chỉnh máy đo quang phổ đến mức zero ở bước sóng 420 nm so với không khí (không có cuvet trong đường quang).

Dùng pipet lấy 2 ml dung dịch thuốc thử ABTS đã pha cho vào cuvet. Đậy cuvet và đặt vào nồi cách thủy hoặc bể làm khô ở 25 °C với thời gian cần thiết để đạt được nhiệt độ này trong cuvet.

Sau đó, thêm 0,05 ml mẫu thử đã pha loãng theo quy định trong 4.1. Đậy ngay cuvet và trộn lượng chứa trong cuvet bằng cách cẩn thận đảo chiều cuvet. Đặt ngay cuvet vào bộ giữ cuvet trong máy đo quang phổ đã làm nóng trước đến 25 °C.

Trong vòng 15 giây sau khi cho mẫu thử đã pha loãng vào dung dịch thuốc thử trong cuvet, đo độ hấp thụ A1 ở bước sóng 420 nm sử dụng không khí để so sánh. Ghi lại độ hấp thụ A2 sau đúng 2 phút.

4.3. Công thức tính hoạt độ enzyme lactoperoxidase

Theo cơ chế phản ứng của phép xác định này, sự thay đổi độ hấp thụ trên phút và hoạt độ enzyme lactoperoxidase có mối quan hệ tuyến tính. Hoạt độ enzyme trong dung dịch pha loãng được xác định bằng độ hấp thụ quang phù hợp với định luật Beer-Lambert.

Tính hoạt độ enzyme lactoperoxidase, bằng đơn vị trên lít (U/l) của mẫu, sử dụng công thức sau:

Trong đó:

• V1 : tổng thể tích dung dịch thử (7.2) (V1 = 2,05 ml), tính bằng mililit (ml);
• V2 : thể tích pha loãng mẫu (7.1) (V2 = 0,05 ml), tính bằng mililit (ml);
• ∆A : chênh lệch độ hấp thụ, (A2 – A1)/min;
• ε : độ hấp thụ của ABTS đã oxy hóa đo ở bước sóng 420 nm (ε = 43,2 μmol-1 cm-1);
• d : chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm) (d = 1,0 cm);
• f : hệ số pha loãng (f = 5 đối với sữa UHT);
• 1000 : hệ số chuyển đổi đơn vị trên lít [U/l];
• 2 : hệ số tỷ lượng.

5. Lưu ý quan trọng khi tiến hành

• Việc sử dụng cuvet thủy tinh hoặc thạch anh có thể cho kết quả quá thấp do thất thoát hấp phụ.
• Đối với một phép đo đáng tin cậy, đảm bảo rằng khoảng thời gian từ khi cho mẫu thử đã pha loãng vào thuốc thử và đọc độ hấp thụ A1 phải ≤ 15 giây.
• Dung dịch đệm chứa dinatri hydrophosphat ngậm hai phân tử nước nồng độ 8,09 mmol/l và kali dihydrophosphat nồng độ 58,6 mmol/l.
• Chuẩn bị dung dịch thuốc thử mới trong ngày sử dụng.

6. Hoạt độ enzyme lactoperoxidase của một số loại sữa

Hoạt độ enzyme lactoperoxidase (UA/mL) trong các loại sữa có sự khác nhau, dao động từ từ 0,14 đến 4,45 UA/mL, với mức trung bình là 1,4 UA/mL ở bò; tuy nhiên, nồng độ tối thiểu cho tác dụng diệt khuẩn là 0,02 UA/mL (Seifu et al. 2005). Về nồng độ cơ chất, oxy phản ứng và ion thiocyanat nằm trong khoảng từ 0,20 đến 0,25 mmol/l để đạt đến hoạt tính tối đa của enzyme, như FAO / WHO trong CAC thiết lập.

Lactoperoxidase là loại enzyme có dồi dào trong sữa bò. Nồng độ của nó trong sữa bò là khoảng 30 mg/l, tương ứng với khoảng 1% whey protein. Hàm lượng lactoperoxidase trong sữa non của bò thấp; tuy nhiên, nó tăng lên theo từng ngày, đạt nồng độ tối đa trong khoảng từ 3 đến 5 ngày sau khi sinh. Sự thay đổi nồng độ enzyme có thể phụ thuộc vào giai đoạn động dục của bò, chế độ ăn uống và giống bò.

7. Các câu hỏi thường gặp (FAQs)