Xác định hoạt độ enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)

Quy trình mô tả dưới đây được sử dụng để xác định hoạt độ enzyme α-amylase một cách đơn giản, tin cậy và nhanh chóng. Cơ chế phương pháp Bernfeld dựa trên việc tăng khả năng khử của dung dịch tinh bột hòa tan. Phản ứng quang phổ được tiến hành để định lượng sản phẩm đường khử từ quá trình thủy phân.

1. Nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme

Một lượng lớn các phương pháp được mô tả để xác định hoạt độ enzyme α-amylase. Chúng dựa trên một trong các hiện tượng được quan sát thấy trong quá trình thủy phân enzyme:

(1) tăng khả năng khử của dung dịch amylopectin hoặc tinh bột hòa tan;

(2) thay đổi tính chất hấp phụ iốt của cơ chất;

(3) giảm độ nhớt của hồ tinh bột.

Cả ba hiện tượng này đều đặc trưng cho hoạt động của enzyme α-amylase. Phương pháp thử mô tả dưới đây dựa trên việc tăng khả năng khử và có thể áp dụng cho cả α-amylase và β-amylase . Mặc dù có thể sử dụng bất kỳ phương pháp nào để xác định lượng đường khử, nhưng phương pháp được mô tả trong bàu viết này đã được chứng minh là đơn giản, tin cậy và nhanh chóng.

2. Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzyme amylase

Hoạt tính của amylase được biểu thị bằng số miligam maltose (C12H22O11.H2O) được giải phóng trong 3 phút ở 20°C với 1 ml dung dịch enzyme, mặc dù, dưới tác dụng của α-amylase, các sản phẩm phản ứng thực tế là dextrin chứ không phải maltose.

3. Thuốc thử, dụng cụ và thiết bị cần thiết

3.1. Thuốc thử

1. Dung dịch đệm (20 mM natri photphat với 6,7 mM natri clorua, pH 6,9 ở 20°C):
   Chuẩn bị dung dịch chứa 2,4 mg/mL natri photphat, và 0,39 mg/mL natri clorua trong nước siêu tinh khiết. Điều chỉnh đến pH 6,9 ở 20°C bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M.
2. Dung dịch tinh bột hòa tan 1,0% (w/v)
   Chuẩn bị dung dịch 10 mg/mL sử dụng tinh bột từ khoai tây trong đệm: Hòa tan dung dịch bằng cách đun sôi trên bếp, khuấy trong 15 phút và trộn. Ngưng gia nhiệt. Tiếp tục trộn đều dung dịch và để nguội đến nhiệt độ phòng.
3. Dung dịch natri hydroxit (NaOH) 2 M – Chuẩn bị dung dịch 80 mg/mL bằng natri hydroxit trong nước siêu tinh khiết.
4. Thuốc thử axit ditrosalicylic (DNS): Hòa tan ở nhiệt độ phòng 1g axit 3,5-dinitrosalicylic trong 20 ml NaOH 2N và 50 ml H2O, thêm 30 g muối Rochelle và định mức đến 100 ml với H2O. Bảo vệ dung dịch trong chai tối màu. Dung dịch này bền trong 6 tháng ở nhiệt độ môi trường nếu tránh ánh sáng.
5. Chuẩn maltose 0,2% (w/v) – Chuẩn bị dung dịch 2 mg/mL trong bình định mức sử dụng D-maltose trong nước siêu tinh khiết.
6. Dung dịch α-Amylase mẫu – pha trước khi sử dụng, chuẩn bị dung dịch chứa 0,75‑1,5 đơn vị/mL α-Amylase trong nước siêu tinh khiết 20°C.

4. Cách tiến hành xác định hoạt độ enzyme

4.1. Phân tích hoạt độ enzyme

1. Thêm 1 ml dung dịch tinh bột vào các ống nghiệm. Trộn bằng máy vortex và cân bằng ở 20°C. Sau đó thêm 1,0ml thể tích enzyme α-Amylase. Mẫu trắng không thêm enzyme được chuẩn bị đồng thời. Trộn đều bằng máy vortex và ủ chính xác trong 3 phút ở 20°C.
2. Sau đó thêm 2,0 ml thuốc thử phản ứng màu DNS vào lần lượt mỗi ống nghiệm để kết thúc phản ứng, đồng thời tiến hành định lượng đường khử. Đậy nắp và đặt hỗn hợp vào nồi cách thủy đang sôi trong đúng 5 phút. Lấy ra khỏi nồi cách thủy đang sôi. Làm lạnh dung dịch trên đá đến nhiệt độ phòng.
3. Thêm 20 ml nước siêu tinh khiết vào mỗi ống nghiệm. Trộn đều dung dịch, tiến hành đo độ hấp phụ quang ở bước sóng 540nm.

4.2. Xây dựng đường chuẩn maltose

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách dùng pipet (tính bằng mL) hút các thuốc thử sau cho vào các dụng cụ chứa thích hợp

Đậy nắp và đặt vào nồi cách thủy đang sôi trong đúng 5 phút. Lấy ra khỏi nồi cách thủy đang sôi. Làm lạnh dung dịch trên đá đến nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 20 ml nước siêu tinh khiết. Trộn đều dung dịch, tiến hành đo độ hấp phụ quang ở bước sóng 540nm.

4.3. Công thức tính hoạt độ enzyme amylase

Tính toán được khối lượng maltose giải phóng từ phản ứng thủy phân sử dụng đường chuẩn đã xây dựng (4.2). Hoạt độ enzyme α-amylase được xác định theo công thức sau:

Trong đố: df: hệ số pha loãng enzyme; thể tích enzyme: lượng enzyme đem phân tích (4.1) (1mL).

5. Lưu ý quan trọng khi tiến hành

• Đối với thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2), hòa tan 1 g cơ chất trong dung dịch đệm acetate 0,016 M, pH 4,8.
• Thời gian 3 phút phản ứng phải được thiết kế thí nghiệm rất chính xác: đồng hồ bấm giờ bắt đầu từ thời điểm enzyme được bơm vào dung dịch; ngay khi hết 3 phút, thuốc thử DNS phải được thêm ngay vào để vô hoạt enzyme.
• Đường chuẩn có thể xây dựng ở các mức nồng độ khác nếu cần thiết.

6. Các câu hỏi thường gặp (FAQS)