Bài viết này hướng dẫn phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô bằng phương pháp Kjeldhal (Determination of total nitrogen and protein contents) đối với các nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩm thủy sản theo TCVN 3705:1990. Nội dung được trình bày ngắn gọn, nhấn mạnh các lưu ý và giải quyết các vấn đề phát sinh để người thực hiện dễ dàng áp dụng và hạn chế sai sót.
MỤC LỤC
1. Đối tượng áp dụng của TCVN 3705:1990
TCVN 3705:1990 quy định phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô bằng phương pháp Kjeldhal đối với các nguyên liệu, bán thành phẩm và sản phẩm thủy sản.
Trên thực tế, phương pháp cũng có thể sử dụng trong phân tích các nguyên liệu thực phẩm khác, với hệ số quy đổi tương ứng (mục 5).
2. Nguyên tắc xác định hàm lượng nitơ tổng số
Thực hiện vô cơ hóa mẫu thử bằng axit sunfuric đậm đặc, nitơ có trong mẫu thử khi đó sẽ chuyển thành amon sunfat. Sử dụng kiềm đặc đẩy amoniac ra khỏi amon sunfat trong máy cất đạm, amon hydroxyt được tạo thành, và tiến hành định lượng bằng axit.
3. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ cần thiết
3.1. Hóa chất
- Axit sunfuric (H2SO4) đậm đặc và dung dịch 0,1N;
- Natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 33% và dung dịch 0,1N;
- Hỗn hợp xúc tác: đồng sunfat (CuSO4) + Kali sunfat (K2SO4), tỷ lệ 1/10 (theo khối lượng);
- Chỉ thị hỗn hợp: 200mg đỏ metyl và 100mg xanh metylen hòa tan trong 200ml etanol (C2H5OH) 96%;
- Phenolphtalein, dung dịch 1% trong etanol 60%.
3.2. Thiết bị và dụng cụ
- Máy cất đạm;
- Bình kendan (Kjeldahl), dung tích 100, 250ml;
- Bình định mức dung tích 100ml;
- Ống đong dung tích 10, 100ml;
- Buret 25ml;
- Pipet 10, 20, 50ml;
- Bình nón, dung tích 250ml;
- Chén cân;
- Phễu thủy tinh;
- Thìa nhựa;
- Bếp điện;
- Giấy lọc không tro;
- Giấy đo pH;
- Cân phân tích, độ chính xác 0,001 g;
4. Quy trình xác định hàm lượng nitơ tổng số
4.1. Chuẩn bị mẫu thử
Cân chính xác 0,3 – 0,5g mẫu thử vào một mẩu giấy lọc không tro, cuộn lại, cho vào bình kendan (Kjeldahl) sao cho mẫu thử không dính vào cổ bình, cho tiếp 1g hỗn hợp xúc tác và 10ml axit sunfuric đậm đặc.
- Nếu mẫu thử là các loại mắm đặc: Lượng nhỏ mẫu thử được cho vào chén cân cùng với một chiếc thìa nhựa. Lấy khoảng 0,5g mẫu thử vào mẩu giấy lọc không tro, cuộn lại, cho vào bình Kjeldahl để tiến hành vô cơ hóa. Thìa nhựa lại đặt vào bình cân, cân khối lượng còn lại được M2. Hiệu số giữa hai lần cân là khối lượng mẫu thử đã lấy để phân tích.
- Nếu mẫu thử là nước mắm (dạng lỏng): Dùng pipet lấy chính xác 10ml nước mắm đã lọc cho vào bình định mức dung tích 200ml, thêm nước cất đến vạch mức và lắc đều. Hút chính xác 20ml dịch pha loãng vào bình Kjeldahl, thêm chất xúc tác và 3 – 5ml axit sunfuric đặc vào để vô cơ hóa.
4.2. Tiến hành
4.2.1. Vô cơ hóa
Dùng phễu nhỏ đậy bình Kjeldhal, đặt bình nghiêng 40 độ trên bếp điện trong tủ hút. Đun 15 -20 phút sao cho chất lỏng trong bình không sủi phồng, không bắn lên cổ bình (có thể để qua đêm rồi mới đun). Sau đó đặt bình thấp gần bếp hơn cho tới khi dịch vô cơ hóa trong bình trong suốt hoặc trong xanh (không được có màu vàng nhạt) mặt trong bình hoàn toàn trong sạch. Ngừng đun, để nguội.
Trong quá trình đun, nếu thấy mẫu không trắng, ngừng đun, để nguội, cho thêm khoảng 0,5g chất xúc tác vào rồi tiếp tục đun. Nếu thấy mẫu còn đen mà đã cạn, thì lấy ra để nguội, cho thêm khoảng 3ml axit sunfuric đậm đặc vào và tiếp tục đun cho tới khi dung dịch đạt yêu cầu như trên.
Lấy chính xác một lượng axit sunfuric 0,1N không lớn hơn 25ml (tùy theo từng loại mẫu thử) và 5 giọt chỉ thị hỗn hợp vào bình nón dung tích 250ml, đặt bình vào dưới ống sinh hàn của máy cất đạm sao cho đầu ống sinh hàn ngập hẳn vào dung dịch.
4.2.2. Trung hòa
Cho cẩn thận dịch đã vô cơ hóa vào bình cất, tráng bình Kjeldhal nhiều lần bằng nước cất cho đến khi nước tráng hết phản ứng axit (thử bằng giấy đo pH). Cho tiếp vào bình cất 5 giọt phenolphtalein 1% và dung dịch natrihydroxyt 33% cho đến khi dung dịch trong bình chuyển thành màu hồng, cho tiếp vào một ít dung dịch kiềm, tráng nước cất cho sạch kiềm ở phễu rồi khóa máy lại. Cuối cùng cho một lớp nước cất cao 1,5 – 2cm trên phễu để kiểm tra độ kín của máy.
(Ghi toàn bộ lượng nước cất đã dùng để biết lượng nước cất cho vào khi chuẩn độ mẫu trắng).
Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn và bắt đầu chưng cất liên tục trong 40 phút kể từ khi dung dịch trong bình bắt đầu sôi. Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước, dùng bình tia rửa đầu ống sinh hàn, tiếp tục chưng cất một vài phút nữa. Sau đó hứng nước chưng chảy ra ở đầu ống sinh hàn, thử bằng giấy đo pH thấy không có phản ứng kiềm là được.
4.2.3. Chuẩn độ
Dùng natri hydroxyt 0,1N chuẩn độ lượng axit dư trong bình hứng cho đến khi dung dịch trong bình chuyển từ màu tím sang xanh lá mạ.
Tiến hành xác định mẫu trắng với tất cả lượng hóa chất và nước cất và các bước thí nghiệm như trên, không có mẫu thử.
4.3. Công thức tính hàm lượng nitơ tổng số và protein thô
4.3.1. Hàm lượng nitơ tổng số
Hàm lượng nitơ tổng số (N) tính bằng phần trăm theo công thức:
Trong đó:
- V1 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml;
- V2 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml;
- m – khối lượng mẫu thử, tính bằng g;
- 0,0014 – Số g nitơ tương ứng với 1ml dung dịch natri – hydroxyt 0,1N;
- 100 – Hệ số tính ra phần trăm.
Chú thích: Đối với nước mắm, mẫu thử được pha loãng 20 lần, lấy 20ml dịch pha loãng để xác định. Hàm lượng nitơ tổng số (N) được tính bằng g/l theo công thức:
Trong đó:
- 20 – Độ pha loãng của nước mắm;
- 10 – Thể tích nước mắm đã pha loãng lấy để xác định, tính bằng ml;
- 1000 – Hệ số tính ra g/l;
4.3.2. Công thức tính hàm lượng protein thô
Hàm lượng nitơ trung bình trong phân tử protein của sản phẩm thủy sản là 16%. Vì vậy hàm lượng protein thô trong mẫu thử bằng hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số 6,25.
Hàm lượng protein thô (P) tính bằng phần trăm theo công thức:
P = N . 6,25
Trong đó:
- N – Hàm lượng nitơ tổng số, tính bằng phần trăm;
- 6,25 – Hệ số chuyển nitơ tổng số ra protein thô (100:16 = 6,25).
5. Lưu ý quan trọng khi tiến hành
- Khi xác định hàm lượng nitơ của một số nhóm thực phẩm khác nhau cần lưu ý hệ số chuyển đổi thành phần nitơ sang protein:
6. Hàm lượng protein trong một số loại thực phẩm
Hàm lượng protein trong một số nhóm thực phẩm được tham khảo từ Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, Dịch vụ Nghiên cứu Nông nghiệp (2009).
6. Các câu hỏi thường gặp (FAQs)
Hàm lượng protein thô (crude protein) là gì?
Xác định hàm lượng Protein thô là một phép phân tích hóa học của thực phẩm. Protein thô được ước tính từ việc xác định hàm lượng nitơ tổng số, bao gồm Nitơ Protein và Nitơ không Protein (NPN)).
Các phương pháp phổ biến xác định hàm lượng nitơ (protein)?
Các phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để đo hàm lượng protein trong thực phẩm bao gồm phương pháp Kjeldahl, phương pháp Dumas, phương pháp Lowry, phương pháp đo trực tiếp bằng quang phổ UV và đo chỉ số khúc xạ.
Tại sao hệ số quy đổi từ hàm lượng nitơ sang hàm lượng protein bằng 6,25?
Hàm lượng nitơ (N) trung bình của protein được tìm thấy là khoảng 16%, dẫn đến việc sử dụng phép tính N x 6,25 (1/0,16 = 6,25) để chuyển đổi hàm lượng nitơ thành hàm lượng protein.
Ngoài phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số, có phương pháp nào khác để định lượng protein không?
Protein trong thực phẩm còn có thể được đo bằng tổng lượng các axit amin riêng lẻ cộng với axit amin tự do khi có dữ liệu về các axit amin phân tích.
TRAU DỒI VỐN TỪ VỰNG TIẾNG ANH CHUYÊN NGÀNH:
Total nitrogen content: Hàm lượng nitơ tổng;
Crude protein: Protein thô;
Protein Nitrogen and Non-Protein Nitrogen (NPN): Nitơ protein và Nitơ phi protein.
1. TCVN 3705-90. Thủy sản – Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô. Aquatic products – Method for determination of total nitrogen and protein contents.
2. Chang SKC. Protein Analysis. 2010:133-146. doi:10.1007/978-1-4419-1478-1_9.
3. CHAPTER 2: METHODS OF FOOD ANALYSIS, FAO.
I am sure this article has touched all the internet users, and it is really a good post on building up a new webpage.