Xác định hàm lượng amylose trong gạo (AACC 61-03)

1. Đối tượng áp dụng của phương pháp AACC 61-03

Phương pháp được nêu trong bài viết sau đây có thể áp dụng để xác định hàm lượng amylose trong gạo xát, gạo đã hồ hóa một phần (parboiled) hoặc trải qua xử lý nhiệt sơ bộ (precooked).

Cần hiệu chỉnh sự khác biệt về độ ẩm đối với các mẫu đã qua xử lí nhiệt, mì gạo,… Gạo lứt phải được xát hoặc khử chất béo.

2. Nguyên tắc xác định hàm lượng amylose

Nguyên tắc xác định hàm lượng amylose là phản ứng tạo phức amylose – iod màu xanh tím trong môi trường đệm axetate pH 4,5-4,8; sử dụng máy đo quang phổ để đo độ hấp phụ của phức chất ở bước sóng 620 nm.

3. Thuốc thử, thiết bị và dụng cụ cần thiết

3.1. Thuốc thử

1. Amylose chuẩn (Amylose potato): ái lực iod khoảng 16% tính trên chất khô. Cân bằng với độ ẩm môi trường phòng thí nghiệm;
2. Amylopectin chuẩn: bột gạo nếp đã khử chất béo, 1-2% amylose. Amylopectin thương mại chứa ít nhất 5% amylose. Hiệu chuẩn với môi trường phòng thí nghiệm;
3. Methanol, 85% (độc);
4. Ethanol, 95%;
5. NaOH, 1,0 N;
6. NaOH 0,09 N;
7. Axit acetic, 1,0N;
8. Dung dịch iod, 0,2% Iod và 2,0% KI trong nước cất.

Cách pha dung dịch iod: Cân 2,0 g kali iodua (chính xác đến 5 mg). Thêm nước để hòa tan KI tạo dung dịch bão hòa (nhỏ hơn 100ml). Thêm 0,2 g iod (chính xác đến 1 mg) vào dung dịch KI vừa pha và khuấy tan.

Khi đã tan hết, chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch và lắc đều. Dung dịch sử dụng trong ngày và bảo quản trong bình tránh ánh sáng.

3.2. Thiết bị và dụng cụ

1. Máy nghiền, loại cyclone hoặc máy trộn hỗn hợp Wig-L-Bug, có khả năng nghiền gạo trắng thành bột lọt hết qua sàng có cỡ lỗ 0,5 mm.
2. Máy đo quang phổ với cuvet thích hợp, có khả năng đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm.
3. Nếu mẫu cần khử chất béo, thiết bị chiết như Soxhlet hoặc Goldfisch.
4. Bình định mức 100 ml, pipet, v..v..

4. Quy trình xác định hàm lượng amylose trong gạo

Quy trình xác định hàm lượng amylose được mô tả trong sơ đồ tổng quát sau:

4.1. Chuẩn bị mẫu thử: Bột gạo

1. Nghiền mẫu thành bột mịn, đồng nhất. Chờ 2 ngày để cân bằng độ ẩm.
   Ngoài các mẫu thử, chuẩn bị thêm: một bộ mẫu đại diện cho các mức amylose có trong mẫu thử nghiệm; mẫu đã khử chất béo và chưa khử chất béo.
2. (Tùy chọn) Tiến hành khử chất béo: chiết hồi lưu mẫu với metanol 85% hoặc ethanol 95% trong 16 giờ bằng hệ thống chiết Soxhlet hoặc trong 4 giờ bằng máy chiết Goldfisch với tốc độ 6 giọt/ giây.
   Sau khi hoàn thành, trải mẫu đã khử chất béo thành lớp mỏng. Đợi 2 ngày để làm bay hơi cồn dư và cân bằng độ ẩm.

4.2. Phân tán đều mẫu bột gạo

3. Cân 100 mg bột gạo (chưa tách béo hoặc đã khử béo) và chuyển vào bình định mức 100 ml. Tiến hành lặp 2 lần.
4. Thêm 1 ml ethanol 95%, cẩn thận rửa sạch phần mẫu bám vào thành bình. Cồn sẽ làm ướt mẫu thử. Để phân tán tốt nhất, lắc đều bằng máy lắc vortex.
5. Thêm 9 ml NaOH 1 N vào mỗi bình. Để phân tán tinh bột, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng 15-24 giờ và không lắc.
   Hoặc để ống ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; sau đó đun sôi 10 phút bằng nồi cách thủy và để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau khi đun nóng trên nồi cách thủy, để mẫu ở nhiệt độ phòng ít nhất 2 giờ (có thể để qua đêm) trước khi tiếp tục quy trình.
6. Sau khi phân tán tinh bột, thêm nước cất đến thể tích 100 ml và lắc mạnh.

4.3. Xây dựng đường chuẩn amylose – amylopectin

7. Chuẩn bị dung dịch (1 g/l) amylose chuẩn (khoai tây) và amylopectin (bột gạo nếp) theo quy trình tương tự bước 3-6.
8. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp amylose/ amylopectin cho đường chuẩn với các tỷ lệ khác nhau như trong bảng sau.

9. Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch amylose/ amylopectin và dung dịch mẫu thử cho vào các bình định mức 100 ml, mỗi bình chứa khoảng 50 ml nước cất. Đối với mẫu trắng, thay bằng 5,0 ml NaOH 0,09N.
10. Thêm 1,0 ml axit axetic 1N và lắc đều.
11. Thêm 2 ml dung dịch iod.
12. Thêm nước cất đến thể tích 100 ml, lắc đều và để yên trong 20 phút.
13. Đo độ hấp thụ màu của dung dịch ở bước sóng 620 nm, mẫu trắng đã chuẩn bị được cài đặt có giá trị= 0 (zero).
14. Vẽ đồ thị độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm với nồng độ amylose thu được đường chuẩn amylose – amylopectin.

4.4. Đo màu iốt cho các mẫu thử nghiệm

15. Dùng pipet lấy 5 ml mẫu chưa tách béo và mẫu thử đã phân tán trong kiềm vào các bình định mức 100 ml, mỗi bình chứa khoảng 50 ml nước cất. Đối với mẫu trắng, dùng 5,0 ml NaOH 0,09N.
16. Lặp lại các bước 10-13 như quy trình xây dựng đường chuẩn.
17. Vẽ đồ thị độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm của các phép kiểm tra không mài mòn so với hàm lượng amyloza được chỉ định. Đọc các giá trị amyloza của các mẫu thử, chính xác đến chữ số thập phân đầu tiên gần nhất từ ​​đường chuẩn thu được với các mẫu kiểm tra không pha loãng.

5. Lưu ý khi tiến hành xác định hàm lượng amylose trong tinh bột

• *Phương pháp xác định hàm lượng amlose trong gạo AACC 61-03 có thể áp dụng thay thế TCVN 5716-2-2017: “Gạo – Xác định hàm lượng amylose. Phần 2: Phương pháp thông dụng”; nguyên tắc phương pháp hoàn toàn tương tự, tuy nhiên, nhà nghiên cứu có thể dễ dàng thực hiện hơn.
• Màu xanh là do dư iot, bền ở pH axit.
• Hàm lượng amylose biểu kiến ​​đo được sẽ khác nhau tùy thuộc vào nguồn amylose và amylopectin được sử dụng làm chất chuẩn.
• Đối với các nguyên vật liệu (amylose, bột gạo nếp, và mẫu phân tích) được cân bằng độ ẩm trong cùng một môi trường, không cần hiệu chỉnh độ ẩm. Kết quả thường được biểu thị trên trọng lượng khô của gạo hơn là trên khối lượng tinh bột.
• Nếu mẫu thử không được khử chất béo, gạo phải được xay kỹ (loại 10% trọng lượng cám và đánh bóng), và mức độ xay xát phải duy trì ổn định để giảm thiểu tác động của lipid đến quá trình xác định amylose.
• Có thể tiến hành phân tích ở các thể tích khác, ví dụ: 60 mg trong 60 ml chất lỏng hoặc 45 mg trong 45 ml. Đối với lượng mẫu lớn, thể tích lớn tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân tán tinh bột.

6. Hàm lượng amylose của một số loại ngũ cốc tiêu biểu

Tùy thuộc vào nguồn tinh bột mà hàm lượng amylose có sự khác biệt đáng kể, điều này tác động to lớn đến các tính chất của tinh bột. Hàm lượng amylose tham khảo của một số tinh bột tiêu biểu (Chen et al. 2003) được trình bày trong bảng dưới đây.

7. Các câu hỏi thường gặp (FAQs)